Peter Parker (Tobey Maguire) ostatecznie odnalazł równowagę pomiędzy swoimi uczuciami do M.J. (Kirsten Dunst), a obowiązkami super bohatera. Na horyzoncie gromadzą się jednak czarne chmury. Kiedy kostium Parkera nagle zmienia kolor na czarny, a jego moc staje się jeszcze większa, metamorfozie ulega również sam człowiek-pająk. Ujawnia się mroczna osobowość Spider-Mana. Na skutek nieujarzmionej pychy, Peter zaczyna zaniedbywać ludzi, na których zależy mu najbardziej. Co gorsza, nie ma czasu na namysły, bowiem miastu i jego najbliższym zagraża nie jeden, a dwa wyjątkowo złośliwe czarne charaktery, Sandman (Thomas Haden Church) i Venom (Topher Grace). Zmuszony do dokonania wyboru między kuszącą mocą nowego kostiumu a dawnym życiem, Parker musi odnaleźć w sobie prawdziwego bohatera, pokonać wrogów i własne demony.
Life finally feels good for Peter Parker. He has managed to balance life as both Spider-Man and as Mary Jane's boyfriend. He is even planning on proposing to MJ. But life isn't always going to be easy for the webbed hero. Harry Osborn still hasn't forgiven Peter for the death of his father. He has developed the perfect technology and crowns himself the 'New Goblin'. Harry isn't the only problem. It is revealed that an escaped convict, Flint Marko is the real killer of Peter's uncle. After an accident, he is now the invincible 'Sandman', who has teamed up with Venom to target the superhero, who is struggling to handle his life.
